通过给 α- 氯醛糖麻醉的猫静脉注射 MK801（一种 N - 甲基 - D - 天冬氨酸（NMDA）受体拮抗剂）或 CP465022（一种 α- 氨基 - 3 - 羟基 - 5 - 甲基 - 4 - 异恶唑丙酸（AMPA）受体拮抗剂），来确定离子型谷氨酸受体在膀胱过度活动和阴部神经调节中的作用。向膀胱内灌注 0.5% 的乙酸（AA）会引发膀胱过度活动。在第一组 5 只猫中，经 AA 刺激后，膀胱容量显著（p<0.05）降低至生理盐水对照组的 55.3±10.0%。在 2 倍阈值强度（2T）和 4 倍阈值强度（4T）下，阴部神经刺激（PNS）显著（p<0.05）使膀胱容量分别增加至生理盐水对照组的 106.8±15.0% 和 106.7±13.3%，T 是诱发肛门抽搐的阈值强度。0.3 mg/kg 的 MK801 阻止了 2T 或 4T PNS 引起的膀胱容量增加。在第二组 5 只猫中，经 AA 刺激后，膀胱容量显著（p<0.05）降低至生理盐水对照组的 49.0±7.5%。然后，在 2T 和 4T PNS 作用下，膀胱容量分别显著（p<0.05）增加至生理盐水对照组的 80.8±13.5% 和 79.0±14.0%。0.03-1 mg/kg 的 CP465022 阻止了 2T PNS 引起的膀胱容量增加，0.3-1 mg/kg 的 CP465022 阻止了 4T PNS 引起的膀胱容量增加。在两组中，0.3 mg/kg 的 MK801 和 1 mg/kg 的 CP465022 显著（p<0.05）增加了刺激前的膀胱容量（分别约为 80% 和 20%），并降低了膀胱收缩幅度（分别约为 30 cmH₂O 和 20 cmH₂O）。这些结果表明股票证券投资，NMDA 和 AMPA 谷氨酸受体对于 PNS 抑制膀胱过度活动很重要，并且这些受体的持续激活也促成了 AA 刺激诱导的膀胱过度活动。
展开剩余92%一、引言
国际尿控学会将膀胱过度活动症（OAB）定义为一种以尿急为特征的综合征，可伴有或不伴有急迫性尿失禁，通常还伴有尿频和夜尿症。目前，OAB 的病理生理学和病因尚不清楚。在美国，约有 3300 万成年人患有 OAB。在普通人群中，OAB 的总体患病率为 16%-17%。目前治疗 OAB 的药物疗法要么疗效有限，要么有显著的副作用，导致许多 OAB 患者拒绝使用这些药物。当药物治疗失败时，OAB 的替代治疗方法可能包括骶神经、阴部神经或胫神经调节疗法。然而，神经调节的机制目前尚不清楚。阐明膀胱神经调节的机制可能会为 OAB 带来更好的治疗方法。
我们之前在猫身上的研究确定了参与骶神经、阴部神经或胫神经调节的多种抑制性神经递质机制。阿片类和大麻素受体是参与胫神经调节的主要受体，而 γ- 氨基丁酸 A（GABAA）、5 - 羟色胺（5-HT）和 β- 肾上腺素能受体在阴部神经调节中很重要。参与骶神经调节的受体包括参与胫神经或阴部神经调节的受体，如阿片类、GABAA 和 β- 肾上腺素能受体。除了这些抑制性神经递质外，兴奋性谷氨酸能神经递质在猫的胫神经或阴部神经对膀胱过度活动的调节中的作用也已被确定。代谢型谷氨酸受体 5 在阴部神经调节中起重要作用，而代谢型谷氨酸受体 2 和 / 或 3 在胫神经调节中起主要作用。然而，离子型谷氨酸受体（NMDA 和 AMPA）是否也参与猫膀胱过度活动的神经调节仍未确定。
本研究检测了 NMDA 和 AMPA 受体对猫膀胱过度活动的阴部神经调节的作用。用稀乙酸刺激膀胱，激活膀胱伤害性传入 C 纤维，诱导膀胱过度活动。对阴部神经进行电刺激以抑制刺激诱导的膀胱过度活动。静脉注射 MK801（一种 NMDA 受体拮抗剂）或 CP465022（一种 AMPA 受体拮抗剂）以抑制谷氨酸能传递，并确定 NMDA 或 AMPA 受体在阴部神经抑制中的作用。在实验过程中还发现，这些受体的激活参与了功能性膀胱容量的调节以及过度活动膀胱的反射性收缩幅度的调节。
二、方法与材料
01. 动物护理和使用委员会批准
匹兹堡大学的动物护理和使用委员会批准了本研究的方案和动物使用。
02. 手术程序
共使用了 10 只猫（8 只雌性和 2 只雄性，体重 2.5-4.5 kg）。手术期间，动物用异氟醚（2-5% 的氧气混合气体）麻醉，然后在数据采集期间切换为 α- 氯醛糖麻醉（初始剂量为 65 mg/kg 静脉注射，并根据需要补充）。对左侧头静脉进行插管，用于输液和给药。通过气管切开术保持气道通畅。通过将导管插入右侧颈动脉来监测全身血压。将脉搏血氧仪（9847V）连接到舌头以监测心率和血氧。通过腹部切口暴露输尿管，结扎并横断以进行外部引流。通过尿道近端的小切口将双腔导管插入膀胱，并通过围绕尿道的缝合线固定到位。用泵通过导管的一个腔以缓慢的速度（1-4 ml/min）向膀胱内灌注生理盐水或 0.5% 的乙酸（AA）。另一个腔连接到压力传感器以测量膀胱压力。在尾巴外侧的坐骨切迹处做一个 3-4 厘米的切口，以暴露右侧阴部神经，用于植入三极袖套电极（NC223pt，MicroProbe）。袖套电极通过恒压刺激隔离器（SIU5）连接到电刺激器（S88）。手术后，所有切口均用缝合线缝合。
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03. 刺激方案和药物给药
使用袖套电极对阴部神经进行刺激（PNS），采用频率为 5 Hz、脉冲宽度为 0.2 ms 的单相矩形脉冲。在实验开始时确定诱发可观察到的肛门括约肌抽搐的强度阈值（T）。根据我们之前的研究，本研究使用 2T 或 4T 强度的 PNS 来抑制膀胱过度活动。
膀胱容量定义为诱导大振幅（>30 cmH₂O）和长时间（>20 秒）膀胱收缩的膀胱容积阈值。最初，在多次膀胱测压图（CMGs）期间确定膀胱容量，这些 CMGs 是通过缓慢地向膀胱内灌注生理盐水进行的。然后，用 AA 代替生理盐水进行膀胱灌注，这会产生膀胱刺激，激活伤害性 C 纤维传入神经并诱导膀胱过度活动。
对于第一组实验动物（N = 5 只猫），一旦在重复的 AA CMGs 期间对照膀胱容量稳定下来，就按以下顺序通过四次 AA CMGs 来确定 PNS 抑制的效果：（1）无 PNS 的对照 CMG；（2）2T PNS 期间的 CMG；（3）4T PNS 期间的 CMG；（4）再次进行对照 CMG 以检查任何刺激后的效果。然后给动物注射累积剂量（0.01、0.03、0.1 和 0.3 mg/kg，静脉注射）的 MK801（一种 NMDA 受体拮抗剂；Sigma-Aldrich）。在注射每剂 MK801 后，重复四次 CMGs（刺激前对照、2T PNS、4T PNS、刺激后对照）以确定药物效果。每剂 MK801 注射后等待 10 分钟以使药物起效。在 CMGs 之间插入 2-3 分钟的等待时间以使膀胱恢复。
第二组实验动物（N = 5 只猫）也使用与第一组相同的实验方案，以测试累积剂量（0.001、0.003、0.01、0.03、0.1、0.3 和 1.0 mg/kg，静脉注射）的 CP465022（一种 AMPA 受体拮抗剂；Tocris Bioscience）的效果。
04. 数据分析
对同一动物的生理盐水对照容量的重复测量（2-3 次 CMGs）进行平均。然后，在每次 AA CMG 期间测量膀胱容量，并将其标准化为在每只猫的生理盐水灌注期间测量的平均对照容量。还测量每次 AA CMG 结束时膀胱收缩的最大幅度。来自不同动物的数据以平均值 ± 标准误差表示。通过重复测量方差分析（ANOVA），然后进行 Dunnett（单向）或 Bonferonni（双向）多重比较来确定统计学显著性（p<0.05）。
三、结果
01. MK801 对 PNS 抑制膀胱过度活动的影响
在这组 5 只猫中，AA 刺激诱导的膀胱过度活动显著（p<0.05）将膀胱容量降低至生理盐水 CMGs 期间测量的对照容量（11.8±2.6 mL）的 55.3±10.0%。PNS 抑制了膀胱过度活动，并显著（p<0.05）将膀胱容量增加至生理盐水对照容量的 106.8±15.0%（在 2T 时）和 106.7±13.3%（在 4T 时）（见图 1 中 CMGs 的第一行和图 2 中的未处理条件）。
在重复的 AA CMG 测试期间，MK801 剂量依赖性地增加了刺激前的膀胱容量（图 1 和图 2）并降低了膀胱收缩幅度（图 1 和图 3）。在 0.3 mg/kg 剂量的 MK801 下，刺激前的容量显著（p<0.05）增加至生理盐水对照的 134.5±30.3%（图 2）。在相同剂量下，当在 AA CMGs 期间应用时，2T 和 4T 强度的 PNS 均未能显著增加膀胱容量（图 2）（图 1）。
图1. 在有或无阴部神经刺激（PNS）的乙酸灌注期间，不同累积剂量的 MK801 下的重复膀胱测压图（CMG）记录。T—— 诱发肛门外括约肌抽搐的 PNS 阈值强度。膀胱压力曲线下的黑色条表示 PNS 的持续时间（5 赫兹，0.2 毫秒，T = 0.4 伏特）。灌注速率 = 4 毫升 / 分钟。
图2. 总结结果显示了不同累积剂量的 MK801 下的膀胱容量。乙酸灌注期间的膀胱容量被标准化为在任何药物治疗或阴部神经刺激（PNS）之前，生理盐水灌注期间测量的容量。* 表示在每种药物剂量下与刺激前数据相比有显著差异（p<0.05）（双向方差分析）。# 表示与同一数据组中的未处理条件相比有显著差异（p<0.05）（单向方差分析）。N = 5 只猫。PNS（5 赫兹，0.2 毫秒，T = 0.16 - 0.6 伏特）。
图3. 总结结果显示了在不同累积剂量的 MK801 下，刺激前 CMG 期间测量的膀胱收缩幅度。# 表示与未处理条件相比有显著差异（p<0.05）（单向方差分析）。N = 5 只猫。
02. CP465022 对 PNS 抑制膀胱过度活动的影响
在这组 5 只猫中，AA 刺激诱导的膀胱过度活动显著（p<0.05）将膀胱容量降低至生理盐水 CMGs 期间测量的对照容量（12.0±2.0 mL）的 49.0±7.5%。PNS 抑制了膀胱过度活动，并显著（p<0.05）将膀胱容量增加至生理盐水对照容量的 80.8±13.5%（在 2T 时）和 79.0±14.0%（在 4T 时）（见图 4 中 CMGs 的第一行和图 5 中 0 mg/kg CP465022 的条件）。
在重复的 AA CMG 测试期间，1.0 mg/kg 剂量的 CP465022 显著（p<0.05）将刺激前的膀胱容量增加至生理盐水对照的 69.4±9.2%（图 4 和图 5）。当在 AA CMGs 期间应用 PNS 时（图 4），在 0.03-1.0 mg/kg 剂量的 CP465022 下，2T PNS 或在 0.3-1.0 mg/kg 剂量下 4T PNS 均不能显著增加膀胱容量（图 5）。1.0 mg/kg 剂量的 CP465022 也显著（p<0.05）降低了膀胱收缩幅度（图 6）。
图4. 在有或无阴部神经刺激（PNS）的乙酸灌注期间，不同累积剂量的 CP465022 下的重复膀胱测压图（CMG）记录。T—— 诱发肛门外括约肌抽搐的 PNS 阈值强度。膀胱压力曲线下的黑色条表示 PNS 的持续时间（5 赫兹，0.2 毫秒，T = 0.3 伏特）。灌注速率 = 1.5 毫升 / 分钟。
图5. 总结结果显示了不同累积剂量的 CP465022 下的膀胱容量。膀胱容量被标准化为在任何药物治疗或阴部神经刺激（PNS）之前，生理盐水灌注期间测量的容量。* 表示在每种药物剂量下与刺激前数据相比有显著差异（p<0.05）（双向方差分析）。# 表示与同一数据组中的未处理条件相比有显著差异（p<0.05）（单向方差分析）。N = 5 只猫。PNS（5 赫兹，0.2 毫秒，T = 0.15 - 1.6 伏特）。
图6. 总结结果显示了在不同累积剂量的 CP465022 下，刺激前 CMG 期间测量的膀胱收缩幅度。# 表示与未处理条件相比有显著差异（p<0.05）（单向方差分析）。N = 5 只猫。
四、讨论
给 α- 氯醛糖麻醉的猫注射 NMDA（MK801）或 AMPA（CP465022）谷氨酸能受体拮抗剂，会抑制由 AA 刺激诱导的 PNS 对膀胱过度活动的抑制作用，这表明这两种类型的受体在抑制过程中都起着重要作用。此外，两种拮抗剂都增加了膀胱容量并降低了反射性膀胱收缩的幅度，这表明 NMDA 和 AMPA 受体的持续激活促成了 AA 诱导的膀胱过度活动。这些结果扩展了先前关于谷氨酸能兴奋性传递在正常膀胱功能中的重要作用的报道，并表明谷氨酸能兴奋性机制在介导膀胱过度活动的反射途径中也很重要。
因为谷氨酸被认为是脊髓中初级传入神经释放的主要兴奋性神经递质，所以阴部神经抑制以及膀胱过度活动很可能是由 MK801 和 CP465022 在脊髓背角的初级传入神经 - 中间神经元突触处的作用所调节的。在基础条件下，AMPA 受体在背角中产生初级传入诱发的单突触兴奋性突触后电位方面比 NMDA 受体更重要。然而，在基础条件下，NMDA 的激活有助于更延迟的兴奋性突触反应，并有助于在伤害性刺激后发生的兴奋性传递的增强。虽然大剂量的 AMPA 和 NMDA 拮抗剂会抑制阴部神经抑制和膀胱过度活动，但在两种药物的剂量反应研究中注意到了细微的差异。CP465022 在不显著改变膀胱容量或膀胱收缩幅度的剂量下抑制阴部神经抑制；而 MK-801 仅在也抑制膀胱活动的剂量下抑制阴部神经抑制。这表明在膀胱反射途径中，由 NMDA 受体介导的传递比在阴部神经抑制途径中更重要和 / 或对 MK801 的阻断更敏感。这种差异可能反映了在向膀胱内灌注 AA 后，NMDA 受体在膀胱反射中的作用增强，这激活了中枢伤害性机制，从而可能揭示了 MK801 对膀胱反射途径的影响。这种可能性可以在未来的实验中通过比较在没有伤害性刺激的情况下生理盐水 CMGs 期间拮抗剂的效果来进行测试。
除了离子型谷氨酸受体对阴部神经调节的作用外，先前在猫身上的研究表明，代谢型谷氨酸受体 5（mGluR5）在 AA 刺激诱导的膀胱过度活动的阴部神经调节中也起着重要作用。然而，这些受体不参与介导膀胱过度活动的反射机制。基于 mGluR5 的已知功能，在阴部神经调节期间这些受体的激活很可能促进了由 NMDA/AMPA 受体介导的突触传递。
膀胱过度活动的阴部神经调节还依赖于涉及 GABAA、β- 肾上腺素能和 5-HT 受体的多种抑制性神经递质机制。GABAA 受体介导的抑制发生在脊髓中，因此很可能涉及局部 GABA 能抑制性中间神经元的谷氨酸能激活。β- 肾上腺素能受体介导的抑制通过反射激活起源于腰上部脊髓的交感神经抑制途径而发生，因此必须涉及一个也依赖于谷氨酸能兴奋性突触的骶 - 腰节间兴奋性途径。阴部神经调节的 5-HT 受体成分依赖于从脑干的中缝核到骶脊髓的血清素能输入，因此必须涉及由从骶脊髓到脊髓上部位的上行谷氨酸能投射激活中缝 5-HT 神经元。因此，在本实验中静脉注射的谷氨酸能拮抗剂很可能通过作用于中枢神经系统内的不同部位来抑制阴部神经调节。
我们的研究表明，AMPA 和 NMDA 受体参与阴部神经调节，这与之前关于大鼠膀胱过度活动的骶神经调节的研究不同，之前的研究表明脊髓 NMDA 受体而非脊髓非 NMDA 受体在骶神经调节中起关键作用。这可能表明存在物种差异或两种类型的神经调节所涉及的机制存在差异。在猫中，膀胱过度活动的骶神经调节部分依赖于阿片类受体和脊髓上 GABAA 受体的激活，而阴部神经调节不涉及阿片类受体，但部分依赖于脊髓 GABAA 受体的激活，如上所述。
MK801 和 CP465022 很可能也作用于中枢神经系统的多个部位，以增加膀胱容量并降低膀胱收缩幅度。排尿反射由脊髓 - 脑干 - 脊髓途径介导，该途径包括：（1）从骶脊髓投射到脑干的上行支，（2）中脑导水管周围灰质（PAG）和脑桥排尿中心（PMC）的脊髓上回路，以及（3）从 PMC 回到骶脊髓的下行支。在大鼠中，谷氨酸已被确定为该途径每个节段中的兴奋性神经递质。全身、鞘内或脑室内注射 AMPA 和 NMDA 谷氨酸能拮抗剂会抑制在乌拉坦麻醉的大鼠的生理盐水或 AA CMGs 期间的膀胱反射。拮抗剂还抑制由膀胱的 AA 刺激诱导的脊髓背角神经元中的 c-fos 表达，这表明 AMPA 和 NMDA 受体在由伤害性刺激触发的过度活动膀胱反射的传入支中起重要作用。在未麻醉的去大脑大鼠的生理盐水 CMGs 期间，AMPA 拮抗剂也有效地抑制反射性膀胱活动，而 NMDA 拮抗剂无效或促进膀胱活动。基于这些实验，有人提出在大鼠的正常排尿反射途径中，兴奋性谷氨酸能传递主要由 AMPA 受体介导，并且只有当 AMPA 受体介导的传递被麻醉剂抑制时，NMDA 受体的作用才会显现出来。另一方面，在新生大鼠脊髓切片中的膜片钳记录显示，AMPA 和 NMDA 受体都参与了向副交感神经节前神经元的脊髓反射途径中的兴奋性传递，以及从外侧索到这些神经元的轴突投射。这些轴突投射可能是固有脊髓或脊髓上途径的一部分。
关于谷氨酸能传递在猫膀胱反射中的作用的信息相对较少。据报道，向去大脑猫的脑桥排尿中心注射谷氨酸能受体激动剂会诱导排尿或促进反射性膀胱收缩；而鞘内注射 MK-801 或犬尿烯酸（KYN）（一种广谱谷氨酸能受体拮抗剂）会阻断由脑桥排尿中心的电刺激引起的膀胱收缩。然而，后一种收缩不会被 CNQX（一种非 NMDA 受体拮抗剂）阻断。离子电泳应用谷氨酸能受体激动剂对猫脊髓中的膀胱副交感神经节前神经元有兴奋作用，离子电泳应用 KYN 会阻断由脑桥排尿中心的电刺激引起的这些神经元的放电。这些研究表明，在猫中，脊髓中的 NMDA 受体参与排尿反射途径的下行支，而脊髓 AMPA 受体不参与该途径。因此，在本研究中，MK801 降低收缩幅度（图 3）的情况可以很好地用脊髓 NMDA 受体在排尿反射途径下行支中的重要作用来解释，在猫身上使用的剂量（0.1 -0.3 mg/kg，静脉注射）与在大鼠身上使用的剂量（相关研究）相同。另一方面，CP465022 降低收缩幅度以及增加膀胱容量（图 6）很可能是通过靶向排尿反射上行支或 PAG - 脑桥回路中的 AMPA 受体，从而减少从脑桥排尿中心到骶脊髓的输入而引起的。
在使用 MK801 治疗的猫中，只有当刺激前的膀胱容量是未治疗条件下测量的容量的两倍以上时，阴部神经抑制才会消失（见图 2）。这引发了一个担忧，即阴部神经抑制的丧失可能不是由于阴部神经到膀胱抑制途径中 NMDA 受体的阻断；相反，可能是由于大的膀胱容积产生了强烈的排尿反射，克服了阴部神经抑制，或者是由于膀胱达到了最大容积，无法通过 PNS 进一步增加。然而，本研究中的数据支持相反的结论。在 0.3 mg/kg 剂量的 MK801 下，刺激前的容量仅为生理盐水对照容量的 134.5±30.3%（图 3），这不太可能是抑制期间的最大膀胱容积。我们之前在猫身上的研究表明，在由 PNS 和 / 或药物产生的抑制期间，排尿反射可以在大约生理盐水对照容量 300-400% 的膀胱容积下发生，这表明最大膀胱容积要大得多。此外，0.3 mg/kg 的 MK801 后的排尿反射似乎较弱，因为排尿收缩的幅度仅为对照的 50%（见图 1 和图 3 中的刺激前 CMG）。这可能是由于 MK801 抑制了脊髓 - 脑干 - 脊髓排尿反射途径的中枢下行支中的谷氨酸能传递，从而产生了较弱的排尿反射，而不是较强的排尿反射。由于排尿反射较弱，并且没有达到诱导反射的最大膀胱容积，所以 0.3 mg/kg 剂量的 MK801 一定是同时抑制了排尿反射并阻断了阴部神经抑制。否则，在 PNS 期间应该会出现膀胱容量的显著增加。
总之，这项在猫身上的研究表明，NMDA 和 AMPA 谷氨酸能机制既参与了反射性膀胱过度活动的产生，也参与了对这种活动的阴部神经调节。这些结果与之前的报告一起表明，阴部神经调节依赖于 NMDA 和 AMPA 谷氨酸能兴奋性传递的激活，而这反过来又刺激了抑制反射性膀胱活动的抑制途径。
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